Cum se cuantifică gelurile de electroforeză prin intermediul imaginilor

Electroforeza este o tehnică esențială folosită pentru clonarea genelor și pentru alte experimente avansate în biologia moleculară. Oamenii de știință folosesc de obicei electroforeza cu un singur scop, pentru a separa componentele moleculare individuale ale ADN-ului, ARN-ului sau proteinelor într-un gel plat. Această procedură permite oamenilor de știință să determine numărul de molecule de un anumit tip care sunt prezente într-o probă și cât de mari sunt aceste molecule. Pentru a face acest lucru, eșantionul este lăsat să migreze de-a lungul gelului, în timpul migrației acesta este împărțit în benzi de dimensiuni diferite la punctele bine definite în gel. În final, gelul care conține moleculele care au migrat este fotografiat. Aceasta este imaginea care trebuie cuantificată pentru a analiza datele.

Cuantificarea imaginilor gelului de la electroforeză

Alegeți un software adecvat pentru analiza imaginilor. Acest lucru este obligatoriu, prin urmare, accesul la software pentru densitometrie, cum ar fi Kodak DirectView EVP Plus și Carestream Molecular Imaging, trebuie obținut în avans. Pe de altă parte, există, de asemenea, programe mai ieftine (de exemplu, Adobe Photoshop) și software-uri gratuite concepute special pentru analiza imaginilor științifice (de exemplu, ImageJ). ImageJ este un pachet gratuit care are toate funcțiile, este utilizat în mod obișnuit în laboratoarele de biologie moleculară și este ușor de operat. În scopul acestui articol, vom folosi ImageJ ca exemplu. Cu toate acestea, principiile fiecărui pas sunt universale și ușor de aplicat la toate tipurile de programe de analiză a imaginii.

Conversia imaginii într-un format utilizabil. ImageJ este compatibil cu multe echipamente de imagistică și camere de luat vederi utilizate în laboratoarele care efectuează electroforeză. Cu toate acestea, este o practică obișnuită de a crea .JPEG, .TIFF sau alte formate de imagine universale de analizat.

Importați imaginea (imaginile) la software-ul de analiză a imaginilor. Unele programe de analiză a imaginii fac ca imaginile importate să aibă o rezoluție mai mică, un contrast diferit și alte probleme de calitate a imaginii, deci este o idee bună să importați toate formatele și să alegeți una cu cea mai înaltă calitate din software ales. ImageJ nu are probleme de rezoluție și păstrează calitatea datelor brute.

Conversia culorii imaginii la "scară gri". În ImageJ, selectați fila "imagine", iar în meniu faceți clic pe "tonuri de gri".

Acesta stabilește parametrii de măsurare adecvați pentru analiză. În fila Analiză, selectați "Setări măsurători", apoi selectați casetele "Zonă", "valori medii de gri" și "Densitate integrată" din meniul drop-down.

Setați scala corectă pentru analiză. În software-ul de exemplu, dați clic pe "Analizați", apoi pe "Setați scara", iar în spațiul unității de lungime scrieți "pixeli".

Schimbați culorile pentru a avea claritate vizuală. În fila Editare, selectați "Invert" astfel încât zonele luminoase să arate întunecate și invers.

Selectați benzile dorite din imagine. În paleta de unelte, selectați instrumentul "Selecție liberă" și trageți cursorul mouse-ului de-a lungul marginii fie a primei benzi, fie a benzii experimentului de control. Selectați numai banda și evitați umbrele de fundal, ceea ce reprezintă în principal zgomot.

Măsurați (care este, cuantificați) zona selectată. Apăsați "m" și în fereastra de rezultate care apare veți găsi măsurătorile densității integrate, zonei, valorii medii a griurilor etc. Repetați pașii anteriori până când ați măsurat toate benzile. Apoi, copiați toate valorile într-o foaie de calcul. Imaginile cuantificate sunt acum gata pentru analiza datelor din programul de calcul tabelar.